一．什么是支原體污染
支原體是一種大小僅為0.2~0.3 um，無細胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45 um）的原核生物，在細胞培養過程中，支原體感染發生率達到63%，因而細胞培養過程中被支原體污染是一個世界性的難題。當細胞（特別是傳代細胞）被支原體污染后，細胞內的DNA、RNA及蛋白表達發生改變，而細胞的生長率一般并未發生顯著的影響，因而細胞被支原體污染一般難以察覺。
二．支原體污染從哪來
細胞培養中有幾種支原體污染與人、牛和豬有關。實驗室的工作人員是口腔支原體、發酵支原體和人型支原體的主要來源。這三種支原體占細胞培養中支原體污染的一半以上，它們主要存在于人的口咽部。精氨/酸支原體和無膽甾原體是另兩類細胞培養中的支原體，它們來自胎牛血清和新生牛血清。胰/酶如果是豬來源的，那么也可能存在豬鼻支原體。
在超凈臺中，用胰蛋/白酶消化該污染的細胞后發現，活的支原體可從細胞培養瓶外的細胞計數板、移液器、廢棄盤中被技術員分離出來。即使過了四至六天，活的支原體仍然可以存在于超凈臺表面，可被成功恢復。在超凈臺里，傳代完被支原體污染的細胞后，再傳代干凈的不含支原體的細胞，結果仍然在6周后被檢測出支原體陽性。這些結果表明，支原體的傳播是多么的快速和容易！它也警告我們，要最大限度的避免支原體的污染，因為一瓶細胞發生污染，就會帶來支原體傳播的可能。
不恰當的消毒導致污染的另一個原因。高壓鍋或干熱烤箱中堆積太多的物品造成加熱不均，使一小部分耗材未得到消毒。滅菌循環時間過短是另一個消毒上犯的錯誤，特別是對于超過500ml的液體，或者是包含固體成分的溶液，或膠體物質如瓊脂、淀粉等。為了實現無菌，滅菌材料的尺寸、質量、性質和體積必須始終考慮。
三．支原體污染怎么測
1.相差顯微境檢測：
將細胞按種于事先放置于培養瓶內的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察。支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間；
2.熒光染色法：
熒光染色用能與DNA特異性結合的熒光染料Hoechst 33258，可使支原體內含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細胞接種蓋玻片上，在細胞未長滿前取出玻片，用不合酚紅的Hanks液漂洗一下，用l： 3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗。置于用生理鹽水配濃度為50pg／ml的Hoechst 33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗1—2min。向細胞面滴加pH5.5磷酸緩沖液數滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點；
3.電鏡檢查：
用掃描電鏡方法簡便快速，也可以利用透射電鏡；
4.DNA分子條文檢查或支原體培養等方法：
檢出率高。但方法較為復雜；
5.PCR檢測支原體污染：
PCR作為一種快速、靈敏、特異且簡便的基因診斷技術已應用于科學研究和疾病的診斷。根據支原體基因組內的保守序列設計特異引物，對待檢樣品的核酸進行擴增，通過對擴增產物的大小分析作出診斷。PCR檢測技術用于支原體污染的檢測，周期短、靈敏度高、特異性好、操作簡單且一次可檢測大量樣品。
四．支原體污染怎么防
1.收到新細胞進行支原體檢測，將支原體檢測陽性的細胞與其他細胞分開處理和培養；
2.在細胞培養過程中，要保證環境的干凈，無菌。對生物安全柜，細胞培養箱定期消毒。實驗器材照紫外，用75%酒精擦拭。實驗耗材進行高壓滅菌；
3.實驗過程中需要的培養基，血清在使用前進行支原體檢測；
4.實驗室要定期打掃，每次使用細胞間要提前打開紫外線燈照射半小時以上。
五．支原體污染怎么治
對于非重要的細胞，如培養中的細胞、WCB的細胞等，將培養物與用過的培養基滅活后丟棄即可。對于較為重要的細胞，如來源珍貴或實驗室中細胞保藏量較小等可以采用以下的方法。
1.用MRA處理：用支原體清除劑（Mycoplasma Removal Agent）處理細胞，作用濃度為 25μg/ml，兩周可以清除支原體。
2.用清洗純化法清除支原體污染的方法：細胞營養馴化→優質細胞群的篩選→細胞清洗→反復離心洗滌，其原理是利用離心力、細胞、微生物質量和懸液的浮力差達到清除支原體的目的。由于支原體個體小且除發酵支原體外多為細胞外寄生,所以通過反復洗滌細胞和低速離心換液使其中潛在的支原體數量降低至/極限. 如結合敏感抗生素的抑殺作用，可達到更好的效果。
3.藥物輔助加溫處理：先用藥物處理后，再將污染的組織培養物放在41℃培養18小時，可殺死支原體，但對細胞有不良影響。
4.使用支原體清除培養基，每2-3天更換1次新鮮培養液，換液時用無菌的平衡鹽/溶液洗滌細胞1-2次；期間如果細胞密度過大，請保持細胞密度適當（貼壁細胞可能需要用胰/酶消化），并更換新的培養器皿，3天之后，即可見明顯清除效果；處理15天后，可以用支原體檢測試劑盒進行檢測，檢測支原體是否殺滅完/全；如果仍有支原體殘留，可以考慮再處理6天；為避免細胞再次受到“支原體"的污染，以后每隔1個月進行支原體的常規檢測，以保證沒有新的支原體污染。
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